凝固法检测发现的凝血时间延长多与凝血因子缺乏或抑制物的存在相关。凝血检测以枸橼酸抗凝全血离心后分离的血浆为样本,既可对凝血功能进行整体评估,也可特异性地检测单一凝血因子的活性。检测样本中,枸橼酸通过结合钙离子发挥抗凝作用,而钙离子为血液凝固酶促反应过程所必需。因此,为启动体外凝血过程,需要进行血浆的复钙。
凝血检测的两大类型为:
凝血检测是测量在凝血级联反应的外源性途径(PT)或内源性途径(aPTT)启动后枸橼酸抗凝血浆凝固的时间。
血浆样本中加入完整凝血活酶即组织因子(TF)、磷脂及氯化钙的混合物后,可激活凝血的外源性途径。
相反,通过加入表面激活剂(如二氧化硅、白陶土或鞣花酸)和稀释的富磷脂凝血活酶提取物(无TF,传统上称为部分凝血活酶)可激活内源性的凝血途径。在发生接触激活后,加入氯化钙以引发凝块形成。
采用凝固法活性检测评估的凝血途径。
由于PT和aPTT反映了不同的初始凝血途径,同时进行两种检测有助于确定导致凝血时间延长的原因。例如,aPTT延长而PT正常表明内源性途径凝血因子缺乏。相反,PT延长而aPTT正常则表明FVII活性降低。
为检测某种凝血因子活性,需要用相应的乏因子血浆将患者血浆样本进行稀释,然后将测定的凝固时间与校准品的测定结果进行比较。例如,为检测FVII活性,需要采用乏FVII血浆将待测血浆样本稀释,并基于PT试验进行上述混合物的检测。如检测FVIII活性,需将待测血浆标本用乏FVIII血浆进行稀释,然后采用基于aPTT的方法进行检测。
PT和aPTT检测还可用于抗凝治疗的监测。通常PT用于监测维生素K拮抗剂的使用,而aPTT通常用于指导普通肝素的抗凝治疗。
此外,将患者血浆与正常血浆混合后再行检测(正常血浆纠正试验—见下文),有助于区分凝血因子缺乏和抑制物(如抗磷脂抗体或凝血因子抑制物)。
PT1 是一种通过激活外源性和共同凝血途径测定纤维蛋白凝固时间,对血浆凝血潜能进行评估的简单而准确的检测方法。
抗凝治疗或潜在的基础疾病可导致PT的延长。在排除上述情况后,PT延长则可能与先天性因子(F) VII或共同途径因子I、II、V或X
因子缺乏相关。试验结果为血浆凝固的时间,以秒为单位,其正常值范围为9-14秒。
为了避免不同实验室由于采用多种PT检测试剂和仪器而带来的系统差异和方便检测结果之间的比较,PT通常以国际标准化比值(INR)来表示。INR通过比较待测样本与正常血浆的PT值,并采用试剂生产商和批次特异性的国际敏感指数(ISI)而计算得出。ISI代表了检测试剂相对于国际参考标准的敏感性。
aPTT1 测量内源性(或接触活化)和共同凝血凝血途径的功能。将测量的凝血时间与对照血浆样本的凝血时间进行比较,以确定是否存在凝血时间延长的情况。aPTT正常值受到各实验室的设置和使用的试剂的影响,但通常在22-40秒之间。
aPTT延长可见于抗凝剂(如肝素)的使用、内源性或共同途径FI、FII、FV、FVIII、FIX、FX、FXI或FXII、高分子量激肽原(HMWK)、激肽释放酶原缺乏或凝血因子抑制物的存在。为进一步鉴别导致凝血功能减低的不同病因,可进行正常血浆纠正试验。纠正试验是指将待测血浆与正常血浆1:1混合,如APTT延长可纠正则为凝血因子缺乏,如不能纠正则可能存在凝血抑制物如肝素、抗磷脂抗体或凝血因子特异性抑制物。
通过PT和aPTT检测评估的凝血活化模式和途径。
缺乏跨膜结构域的可溶性重组组织因子(sTF)可用于测量血浆FVIIa水平。与野生型TF不同,该sTF分子虽然可以与FVIIa结合,但不能将FVII活化为FVIIa。由于凝固时间与已经活化的FVII的量成正比而与无活性FVII酶原的含量无关,因此sTF可用于检测待测样本中FVIIa的含量。
将枸橼酸抗凝的乏血小板待测血浆用乏FVII血浆稀释。随后加入含有sTF、磷脂囊泡和氯化钙的试剂以引发血液凝固。然后可以使用标准血浆参考曲线将凝血时间转换为FVIIa水平。还可以使用已知浓度的血浆来源或重组FVIIa(参照国际FVII浓缩物标准校准后)生成校准曲线。
基于凝固法的FVIIa特异性活性检测原理。
无论是通过免疫吸附法制备或是来源于先天性FVII缺乏的供者,乏FVII血浆中任何残留的FVIIa都可对检测的有效性产生影响,特别是待测标本中FVIIa活性极低时。应避免与非硅化玻璃和冷藏物或溶液接触,以防止检测样本中FVII酶原的活化。2
正常血浆纠正试验可用于区分凝血因子缺乏或抑制性抗体。在该检测中,患者血浆与正常混合血浆以1:1的比例混合。
如果患者血浆aPTT延长是由于凝血因子缺乏所致,则正常血浆可提供缺失的凝血因子,aPTT可被纠正至正常。如果患者血浆aPTT延长是由于抑制性抗体所致,则正常血浆中的凝血因子也将被待测血浆中的抗体所抑制,因而aPTT不被纠正。
通常情况下,如果正常血浆不能将aPTT纠正超过50%则应考虑存在抑制物3。然而不同实验室对纠正试验的结果亦可能采用不同的判定标准,对此目前国际上仍未达成共识。由于FVIII抑制物具有时间和温度依赖性,因此混合血浆应在37°C下孵育1-2小时后进行检测。3,4 如果未孵育1-2小时或在较低温度(例如室温)下进行纠正试验,可导致aPTT被纠正而漏诊抑制物。
正常血浆纠正试验可用于鉴定血友病A(HA)或血友病B(HB)患者是否分别存在FVIII或FIX同种异体抗体,以及获得性HA(AHA)患者的FVIII自身抗体。即使正常血浆可纠正aPTT,并不能完全排除FVIII抑制物。因此,如果临床提示存在抑制物,需要进一步进行抑制物滴度定量(Bethesda) 检测。
基于PT或aPTT的因子活性检测是通过测定不同比例稀释后(通常至多3个稀释度)待测血浆的凝固时间并与参考标准(“正常”)血浆的不同稀释结果进行比较,得出待测血浆中凝血因子活性水平的定量结果。
待测血浆与定标血浆采用乏因子血浆进行稀释。该乏因子血浆除了不含待测的凝血因子,其它凝血因子含量正常。乏因子血浆可通过免疫吸附法制备或来源于凝血因子缺乏的供者如重型HA(FVIII完全缺乏)或HB(FIX缺乏)患者。然后对不同比例稀释的混合血浆进行aPTT检测。
随后对不同比例稀释的混合血浆进行PT(拟测定因子II、V、VII或X活性时)或aPTT检测(拟测定因子VIII、IX、XI、XII、HMWK或PK活性时)。
将参考标准品PT或aPTT凝固时间的结果在对数(因子活性)-线性(凝固时间)图上绘制出标准曲线,然后根据稀释后待测标本凝固时间的结果可计算出原始待测血浆中的凝血因子活性。
如待测标本进行了多点稀释,而受检血浆曲线与标准曲线不呈平行关系,则提示抑制物的存在而非凝血因子缺乏。
基于PT或aPTT的因子活性检测原理。
1. Bates SM, Weitz JI. Coagulation assays. Circulation 2005;112:e53-60.
2. Amiral J, Dunois C, Amiral C, Seghatchian J. The various assays for measuring activity states of factor VIIa in plasma and therapeutic products: Diagnostic value and analytical usefulness in various pathophysiological states. Transfus Apher Sci 2017;56:91-7.
3. Kasper CK. Diagnosis and management of inhibitors to factors VIII and IX: an introductory discussion for Physicians. World Federation of Hemophilia (WFH) 2004;34:1-26.
4. Lossing TS, Kasper CK, Feinstein DI. Detection of factor VIII inhibitors with the partial thromboplastin time. Blood 1977;49:793-7.