遗传学分析

凝固法和／或发色底物法FVII活性检测可确定先天性因子(F) VII缺乏症(FVII CD)的诊断。采用发色底物法FXIII活性检测和FXIII抗原检测可确定先天性因子(F) XIII缺乏症(FXIII CD)的诊断。血小板功能检测可诊断血小板无力症(GT)。专业实验室可进一步行基因检测以确定相应的分子遗传缺陷。

一旦根据发色底物法和／或凝固法FVII(a)活性检测确定FVII CD的诊断，可于专业实验室进一步行相应基因检测。通常采用聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增，然后通过测序确定突变类型。目前已报道有众多的FVII基因多态性和突变类型，包括点突变、错义突变、无义突变、剪切位点突变、小片段缺失和重排。

一旦根据发色底物法和/或凝固法 FVIII 活性检测确认血友病 A 的诊断后，可在专业实验室对潜在分子基因缺陷进行定性。基因分型一般通过采用基于聚合酶链反应 (PCR) 的方法扩增 DNA，然后进行测序，以检测突变和结构变体。

根据具有相同突变的其他个体，基因分型结果可用于预测出血严重程度和产生抑制物的风险。确定血友病 A 先证者的基因突变后，还可确定女性亲属中的携带者状况，并用于遗传咨询和产前诊断。FVIII 基因中已发现至少 2500 种突变，但并非所有突变都可能影响 FVIII 的表达或功能。此外，可能还有更多新的功能突变有待发现。²

一旦根据发色底物法和/或凝固法FVIII活性检测确定血友病B的诊断后，可在专业实验室对潜在分子基因缺陷进行定性。基因分型一般通过采用基于聚合酶链反应 (PCR) 的方法扩增 DNA，然后进行测序，以检测突变和结构变体。

根据具有相同突变的其他个体，基因分型结果可用于预测出血严重程度和产生抑制物的风险。确定血友病 B 先证者的基因突变后，还可以确定女性亲属中的携带者状况，并用于遗传咨询和产前诊断。虽然并非所有基因变异都可能影响 FIX 的表达或功能，但目前 FIX 基因中已发现至少 1000 种突变，可能还有更多新的功能突变有待发现。³

根据凝固法或发色底物法 FXI 活性检测确认 FXI CD 后，可于专业实验室对其潜在的基因缺陷进行检测。通过采用基于聚合酶链反应 (PCR) 的方法及随后的测序，对预期存在已知突变基因区域的DNA进行扩增，可以测定来自具有已知FXI CD建立者效应群体的患者突变。在没有 FXI CD 家族史或潜在的已知建立者突变的情况下，可能需要 FXI 基因的完整分子序列，包括影响转录或剪接的非编码区。⁴

一旦根据发色底物法活性检测确定FXIII CD，并采用FXIII抗原检测确定其亚型后，可于专业实验室行相应的分子遗传缺陷的检测（仅用于研究目的）。^2,,3 对F13A1 和F13B 基因的外显子和调控区域的完整测序可发现致病性的基因变异。4  通常采用聚合酶链式反应(PCR)进行DNA扩增，然后通过测序确定突变类型。

应用血小板功能检测诊断GT后，可进一步通过分子遗传学检测确定诊断。通常基于PCR原理对包含ITGA2B和ITGB3 基因的基因组DNA进行扩增（含所有45个外显子和相关的剪切位点），通过测序确定突变类型。已报道有大量的基因多态性位点和突变类型，包括错义突变、无义突变和剪切位点突变、小片段缺失、插入和倒位。已发现的突变应采用二次DNA分析验证.^5,6

聚合酶链式反应(PCR)

可使用PCR对选定区域DNA进行扩增。将具有靶序列的DNA与DNA聚合酶、两个寡核苷酸引物及核苷酸混合。目标DNA的单个起始分子即可通过PCR大量扩增寡核苷酸引物之间的DNA片段。与靶DNA序列两端互补的引物，可在DNA聚合酶的作用下不断延伸并合成模板DNA的互补序列。

使用PCR扩增目标DNA序列的概述

测序

虽然目前DNA测序多为自动化进行，但其原理一般基于Sanger双脱氧链终止法。该方法以含有待测基因片段的相同单链DNA分子（如通过PCR扩增获得）为模板，在同一位置与短链寡核苷酸引物结合。以引物为起点，DNA聚合酶将脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)聚合成互补DNA链。除四种dNTP之外，将少量四种双脱氧核苷酸 (ddNTPs). （分别用不同的荧光基团标记）添加至混合物中。ddNTPS 由于缺乏下一个核苷酸后续聚合所需的3'-羟基，可导致其掺入位置DNA合成的中止。这导致一系列以四种荧光标记的ddNTP中一种为末端的不同长度DNA链的合成。聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离不同长度的DNA链，即使仅相差一个核苷酸。通过检测电泳凝胶上荧光条带的序列，可进而确定目标DNA的序列。

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2. Bolton-Maggs PH, Favaloro EJ, Hillarp A, Jennings I, Kohler HP. Difficulties and pitfalls in the laboratory diagnosis of bleeding disorders. Haemophilia 2012;18 Suppl 4:66-72.

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