发色底物法FVII活性检测基于凝固法FVII检测相同的原理，主要差别在于因子活性定量检测的终点不同。目前已经开发有两种发色底物法检测方法，这两种检测方法都使用了FXa特异性底物来量化上游的酶促活性。
传统的FVII发色底物法检测中，FVII酶原在凝血活酶和钙的作用下首先转化为FVIIa，然后通过FXa活性来测定总FVII(a)的浓度。而近期的FVII发色底物法检测可特异性测定枸橼酸抗凝血浆中FVIIa的活性。重组截短的可溶性组织因子(sTF)可以与FVIIa结合，但不能活化FVII酶原。在存在磷脂和钙的情况下，sTF-FVIIa复合物可活化FX，而FXa可进一步裂解特定的肽类底物。亦可使用FVIIa特异性抗体进行检测。在该检测方法中，FXa的活性与FVIIa活性成正比。采用合成磷脂可减少杂质的干扰并提高检测的特异性，特别是低凝血因子活性水平的样本。1
发色底物法FVIIa检测示意图。
发色底物法FVIII活性检测由二期凝固法检测衍生而来,2,3 可用于测定FVIII的功能活性。在发色底物法FVIII活性检测中，第一步包括将待测血浆与凝血酶(FIIa)或凝血酶原(FII)、FIXa、FX、磷脂和钙混合，以活化FX (FXa)。第二步加入凝血酶抑制剂和FXa特异性的发色底物，通过监测发色底物肽的裂解来量化FXa活性水平。4
发色底物法FVIII检测的示意图。
发色底物法检测FIX活性时，第一步包括将待测血浆与FXIa、FVIII、凝血酶(FIIa)或凝血酶原(FII)、FX、磷脂和钙混合，这导致FX (FXa)的FIX依赖性活化。第二步加入脱靶（非FXa）酶抑制剂和FXa特异性的发色底物，通过监测发色肽底物的裂解来量化FXa活性水平。4
发色底物法检测FIX的示意图
国际血栓与止血学会(ISTH)因子XIII和纤维蛋白原SSC分委会建议将FXIII活性检测作为FXIII缺乏的 “一线” 筛查试验。5 该检测主要基于以下两个原理：测量在转谷氨酰胺酶反应第一个步骤中的氨释放；或测量与活化FXIII（FXIIIa）蛋白底物共价交联的标记胺。5-8 较新的荧光检测方法则是基于FXIIIa的异肽酶活性。7,8
氨释放法
在氨释放检测中， FXIIIa介导的转谷氨酰胺酶反应过程中产生的氨可采用分光光度计通过谷氨酸脱氢酶(GIDH)介导的指示反应来测量，即还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)转化为NADP。5,7,8 首先，血浆中的FXIII被凝血酶和Ca2+活化，血浆凝固被纤维蛋白聚合抑制肽抑制。5,8 然后FXIIIa催化含氨基底物与寡肽中谷氨酰胺残基之间的交联反应，由此释放氨。5,8
1.延迟期间的活化：
2.转谷氨酰胺酶反应：
3.监测氨的释放：
通过光度测量氨释放检测FXIII活性的原理。8
因为在血浆中存在独立于活化FXIII的其他消耗NADPH和产生氨的反应，所以可能出现高估FXIII活性的情况，这一问题在低活性范围内尤其显著。5,7,8因此，需要用血浆空白样本进行平行检测，并且必须从检测值中减去空白值，以便精确地确定FXIII活性。5,7,8 氨释放法的另一个缺点是灵敏度相对较低，其定量检测的最低限在3％到5％之间。5,8
胺掺入法
在胺掺入法中，荧光、放射性同位素标记或生物素化的胺底物在FXIIIa的作用下与蛋白质底物的谷氨酰胺残基共价结合。随后需要将未结合的游离胺底物分子与蛋白质结合的部分分离。5,8 通过测量掺入的荧光或放射性同位素标记的胺底物或通过使用链霉亲和素介导的酶反应（若为生物素化胺）来量化后者。8 与氨释放法一致，初始FXIII的活化由凝血酶及Ca2+介导。5
1.反应过程中的活化：
2.转谷氨酰胺酶反应：
3.掺入胺的测定：
胺掺入法检测FXIII活性的原理。
胺掺入法检测是FXIII活性的第一个定量检测方法。该方法敏感性高，甚至可检测低于1 IU/dL (%)的血浆FXIII活性水平。8 然而该方法的缺点是耗时长，难以标准化，分离步骤使得几乎不可能设计真正的动力学检测。5,8此外，高加索人群中常见的FXIII-A Val34Leu多态性可能影响那些在FXIII活化初始阶段测量转谷氨酰胺酶活性的胺掺入检测方法。5,8 相反，测量完全活化后的转谷氨酰胺酶活性的胺掺入检测方法则不受这种多态性的影响。5,8
荧光检测
近期的荧光检测方法是基于活化FXIII在某些条件下可通过其异肽酶活性释放与寡肽中谷氨酰胺残基结合的伯胺。8 逐步除去含有猝灭剂的胺，可导致用荧光基团标记的肽底物的荧光增强。8 然而，与氨释放法相比，荧光检测的灵敏度甚至更低，且检测结果之间相关性较差。8
荧光异肽酶法检测FXIII活性检测的原理。
