Pruebas del factor von Willebrand

El factor von Willebrand (VWF) facilita la adhesión de las plaquetas a través del complejo de glicoproteína Ib/IX/V (GPIb/IX/V) en la superficie de las plaquetas, y el complejo de glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa; integrina α_IIb/β₃) media la adhesión a la fibrina o la fibronectina asociada a la pared vascular. Las pruebas de actividad del VWF determinan la capacidad del VWF para unirse a las plaquetas o a la GPIb. La prueba de unión del VWF/factor VIII se utiliza para distinguir el subtipo 2N de otros subtipos de la enfermedad de von Willebrand (VWD) tipo 2, y el análisis de los multímeros del VWF suele realizarse después de las pruebas iniciales del VWF para ayudar a definir el subtipo de la variante de VWD.

TLa prueba de la actividad del cofactor de ristocetina del VWF (VWF:RCo) determina la capacidad del VWF para unirse a las plaquetas con un instrumento (normalmente un agregómetro) a fin de determinar la agregación plaquetaria en presencia del antibiótico ristocetina. Esta prueba suele realizarse junto con una prueba de antígenos del VWF para calcular la proporción entre el nivel del VWF frente a la función del VWF de la clasificación de la VWD ipo 1, 2 o 3. Sin embargo, la variabilidad entre laboratorios y en el laboratorio asociada a la prueba VWF:RCo aumenta la posibilidad de obtener un diagnóstico erróneo.^1-5

En la prueba VWF:glicoproteína-IbR (VWF:GPIbR) se utiliza ristocetina para desencadenar la unión del VWF a la GPIb tipo natural derivada del plasma o recombinante. Este prueba está disponible para aplicaciones automatizadas y puede utilizarse como una alternativa precisa y sensible a la prueba VWF:RCo para determinar la actividad del VWF.⁵

La prueba VWF:glicoproteína-IbM (VWF:GPIbM) también puede utilizarse como alternativa a la prueba VWF:RCo durante el diagnóstico diferencial y la clasificación de la VWD. Al igual que las pruebas VWF:RCo y VWF:GPIbR, la prueba VWF:GPIbM determina la función del VWF. No obstante, la prueba VWF:GPIbM determina la unión del VWF a una versión modificada de ganancia de función de una proteína GPIb independiente de la ristocetina, lo que puede reducir la variabilidad entre laboratorios y en el laboratorio. La prueba VWF:GPIbM se utiliza junto con la prueba de antígenos del VWF para crear una relación entre cantidad y función del VWF para la clasificación inicial de la VWD.^2-5

La prueba de agregación plaquetaria inducida por ristocetina (RIPA) es parecida a la prueba VWF:RCo. No obstante, se utiliza para distinguir la VWD tipo 2B y la VWD tipo plaquetario de la VWD tipo 2A. En la RIPA, una muestra de plasma rico en plaquetas del paciente se expone a bajas concentraciones de ristocetina con un instrumento (normalmente un agregómetro) para determinar la agregación. En las muestras de los pacientes con VWD tipo 2B y VWD tipo plaquetario se agregará en estas condiciones, mientras que en las muestras de los pacientes normales y de los pacientes con todos los demás tipos de VWD se expresará poca o ninguna agregación.^1,4

La prueba de unión a plaquetas del factor von Willebrand (VWF:PB) se utiliza para distinguir a los pacientes con VWD tipo 2B de los que tienen VWD tipo 2A, VWD tipo plaquetario y pseudo-VWD. En la prueba VWF:PB se utilizan plaquetas normales fijadas con paraformaldehído en presencia de ristocetina de concentración baja y la capacidad de unión del VWF se determina con un anticuerpo marcado. Se observan aumentos en la VWF:PB de las muestras de pacientes con VWD tipo 2B. En esta prueba las muestras de los pacientes con VWD tipo 1, 2A, 2M, 2N, 3 y VWD tipo plaquetario no suelen unirse a las plaquetas.^1,4

Esta prueba de unión del factor von Willebrand al factor VIII (unión del VWF al FVIII) se utiliza para distinguir el subtipo 2N de otros subtipos de VWD tipo 2. En esta prueba se utiliza una técnica modificada del ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). Los anticuerpos frente al VWF se siembran en una placa y capturan el VWF cuando se exponen a la muestra del paciente. A continuación, la placa se lava para eliminar el FVIII endógeno unido al VWF en la muestra. La placa, con el FVIII capturado, se expone a una concentración conocida de FVIII recombinante. Finalmente, se utiliza un anticuerpo frente al FVIII con actividad enzimática para determinar la concentración del FVIII unido al VWF del paciente. Con esta prueba los pacientes con VWD tipo 2N suelen presentar un FVIII disminuido.^6,7

El análisis de los multímeros del factor von Willebrand (VWF) suele realizarse después de las pruebas iniciales de la VWD para ayudar a definir el subtipo de la variante de la VWD. En esta prueba cualitativa, los multímeros del VWF se separan por tamaño mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) y agarosa. La distribución de los multímeros se visualiza con el anticuerpo marcado que se dirige al VWF. Este análisis también puede realizarse mediante la transferencia de la proteína del gel de SDS-agarosa a una membrana con la técnica de Western blot. Con este método, los multímeros del VWF se visualizan mediante inmunofluorescencia.^6,7

Los geles de baja resolución pueden utilizarse para separar los multímeros del VWF de alto peso molecular y a menudo se utilizan para diferenciar los tipos 2A y 2B de la VWD de los tipos 1, 2M, 2N y 3. Las muestras de pacientes con VWD tipo 2A y 2B tienen menos multímeros de VWF de alto peso molecular, mientras que las muestras de pacientes con VWD tipo 1, 2M y 2N suelen tener una distribución normal. No se detectan multímeros en las muestras de los pacientes con VWD tipo 3.⁶

Resultados típicos del análisis de multímeros de VWD.⁶

1. Nichols WL, Hultin MB, James AH, et al. von Willebrand disease (VWD): evidence-based diagnosis and management guidelines, the National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Expert Panel report (USA). Haemophilia 2008;14:171-232.
2. Keesler DA, Flood VH. Current issues in diagnosis and treatment of von Willebrand disease. Res Pract Thromb Haemost 2018;2:34-41.
3. Sharma R, Flood VH. Advances in the diagnosis and treatment of Von Willebrand disease. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2017;2017:379-84.
4. James AH, Eikenboom J, Federici AB. State of the art: von Willebrand disease. Haemophilia 2016;22 Suppl 5:54-9.
5. Bodo I, Eikenboom J, Montgomery R, et al. Platelet-dependent von Willebrand factor activity. Nomenclature and methodology: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 2015;13:1345-50.
6. Nichols WL, Hultin MB, James AH, et al. von Willebrand disease (VWD): evidence-based diagnosis and management guidelines, the National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Expert Panel report (USA). Haemophilia 2008;14:171-232.
7. James AH, Eikenboom J, Federici AB. State of the art: von Willebrand disease. Haemophilia 2016;22 Suppl 5:54-9.