Un tiempo de coagulación prolongado determinado por una prueba coagulométrica suele asociarse a deficiencias en los factores de coagulación o la presencia de inhibidores. Las pruebas de coagulación pueden emplearse para una evaluación global o para la prueba específica de la actividad de factores de coagulación individuales. El material de muestra utilizado es plasma preparado mediante la centrifugación de sangre total citratada. El citrato de la muestra actúa como un anticoagulante enlazando los iones calcio, cuya presencia es esencial para los procesos enzimáticos que conducen a la formación de un coágulo. Por consiguiente, para iniciar el proceso de coagulación in vitro se necesita la recalcificación del plasma.
Los principales tipos de pruebas de coagulación son:
Las pruebas de coagulación miden el tiempo que requiere el plasma citratado para coagularse luego del inicio de la vía extrínseca (PT) o intrínseca (aPTT) de la cascada de coagulación plasmática.
La vía extrínseca se activa con la añadidura de tromboplastina
completa, una mezcla de factor tisular (TF), fosfolípidos y
CaCl2, a las muestras de plasma.
En cambio, la vía intrínseca se activa con la añadidura de un activador de superficie, tal como sílice, caolín o ácido elágico y un extracto enriquecido con fosfolípidos diluidos de tromboplastina sin TF, conocido históricamente como tromboplastina parcial. Luego de ocurrida la activación por contacto, se agrega CaCl2 ipara iniciar la formación del coágulo.
Vías de coagulación evaluadas mediante las pruebas coagulométrica.
Dado que el PT y el aPTT abordan distintas vías iniciales, la aplicación de ambas pruebas en paralelo resulta útil para precisar la causa subyacente de los tiempos de coagulación prolongados. Por ejemplo, un aPTT prolongado con un PT normal indica deficiencia de un factor en la vía intrínseca. En cambio, un PT prolongado con un aPPT normal indica una actividad del FVII reducida.
Para probar la actividad de un factor de coagulación específico, la muestra del plasma del paciente se diluye en un plasma con deficiencia de dicho factor y se miden los tiempos de coagulación y se comparan con los de los calibradores de referencia. Por ejemplo, para verificar la actividad del FVII, la muestra de plasma se diluiría en un plasma con deficiencia del FVII y las mezclas se verificarían mediante la prueba de PT. Por otro lado, para verificar la actividad del FVIII, la muestra de plasma se diluiría en un plasma con deficiencia del FVIII y las mezclas se verificarían mediante la prueba de aPTT.
Ambas pruebas, PT y aPTT, también se utilizan para monitorear el tratamiento anticoagulante. Mientras que el PT se utiliza para monitorear la aplicación de antagonistas de la vitamina K, el aPTT suele aplicarse para guiar el tratamiento con heparina no fraccionada.
Además, se puede mezclar el plasma del paciente con plasma normal antes de introducir las muestras a las pruebas (estudios de corrección - ver abajo) a fin de discriminar entre deficiencias de un factor y la presencia de inhibidores, tales como anticuerpos antifosfolípidos o inhibidores de factores de la coagulación.
El aPTT1 mide la funcionalidad de las vías de la cascada de coagulación intrínseca (o de activación por contacto) y común. El tiempo de coagulación medido se compara con el de las muestras de plasma de control a fin de determinar si existe una demora en el tiempo de coagulación. Los valores de aPTT normales dependen de la configuración del laboratorio en particular y de los reactivos empleados, pero suelen estar entre 22 y 40 segundos.
Un aPTT prolongado puede identificar la presencia de anticoagulantes tales como heparina, deficiencias de FI, FII, FV, FVIII, FIX, FX, FXI o FXII intrínsecos o comunes, cininógeno de alto peso molecular (HMWK), precalicreína o la presencia de inhibidores de un factor de la coagulación. Para distinguir entre estas posibles causas de capacidad reducida de coagulación, se realizan los estudios de corrección. El aPTT de una mezcla 1:1 de plasma de prueba con plasma de control se corregirá en presencia de deficiencia de un factor, pero no en presencia de un factor inhibidor como la heparina, los anticuerpos antifosfolípidos o un inhibidor del factor de coagulación.
Mecanismo de acción y vías evaluadas por las pruebas de PT y aPTT.
Se puede emplear un factor tisular recombinante soluble (sTF) específico que carece de dominio transmembrana para medir los niveles de FVIIa en el plasma. A diferencia del TF natural, el sTF tiene la cualidad de que la molécula se enlaza al FVIIa, pero no puede convertir el zimógeno FVII en FVIIa. Por consiguiente, el sTF puede utilizarse para evaluar la cantidad de FVIIa en una muestra, dado que el tiempo de coagulación es directamente proporcional a la cantidad de FVII ya activo y es independiente de la presencia del zimógeno FVII inactivo.
El plasma de prueba citratado pobre en plaquetas se diluye/mezcla con plasma con deficiencia de FVII. Posteriormente, se agrega un reactivo con sTF, vesículas fosfolipídicas y CaCl2 para iniciar la coagulación. Los tiempos de coagulación se pueden convertir a niveles de FVIIa usando una curva de referencia plasmática estándar. También se puede generar una curva de calibración usando una concentración conocida de FVIIa proveniente del plasma o recombinante que se haya calibrado contra un estándar de concentración de FVII internacional.
El Principio subyacente de las pruebas coagulométricas de actividad específicas del FVII.
Cualquier FVIIa residual en el plasma con deficiencia de FVII, independientemente de si se sometió a inmunodepleción o proviene de donantes con deficiencia congénita, puede afectar la utilidad de la prueba, especialmente en muestras con muy poca actividad del FVIIa. Se debe evitar el contacto con vidrio no siliconado y el almacenamiento o las soluciones frías para evitar la activación involuntaria del zimógeno FVII en las muestras de prueba.2
Las pruebas de actividad de un factor basadas en PT o aPTT miden el tiempo de coagulación de una o más (generalmente hasta tres) diluciones de plasma de prueba en comparación con diluciones en serie de plasma estándar de referencia ("normal") para cuantificar el nivel de actividad del factor en el plasma de prueba.
Tanto el plasma de prueba como el plasma de referencia se diluyen y se mezclan con el plasma con deficiencia de un factor, por lo general, plasma que contiene todos los factores de coagulación en cantidades normales salvo por el factor de interés. El plasma con deficiencia de un factor puede generarse por inmunodepleción o sangre de donantes con, por ejemplo, HA grave (careciente de FVIII por completo) o HB (FIX). Se realiza entonces la prueba de aPTT en cada mezcla de dilución.
Se realiza una prueba de PT (en el caso de los factores II, V, VII o X) o de aPTT (para factores VIII, IX, XI, XII, HMWK o PK) en cada mezcla de dilución.
Los datos del tiempo de coagulación del PT o aPTT de los estándares de referencia se grafican e interpolan en una representación semilogarítmica (donde la actividad del factor se representa en la escala logarítmica y el tiempo de coagulación en la escala lineal) a fin de poder calcular la actividad del factor en la muestra de prueba original en base a los tiempos de coagulación medidos de la(s) dilución(es) de la muestra.
En caso de que se hayan estudiado distintas diluciones de la muestra de prueba, la falta de paralelismo entre las líneas de interpolación indicaría la presencia de un inhibidor más que la deficiencia de un factor.
Principio subyacente de las pruebas de actividad de un factor basadas en PT o aPTT.
